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KAPA hgDNA定量(liang)&QC試(shi)劑盒(he)，包含(han)人類基因組DNA樣(yang)品NGS文庫構建前，所有基于qPCR定量(liang)及質量(liang)評(ping)估的試(shi)劑。

KAPA hgDNA定量&QC試(shi)劑盒(he)(he)，是基(ji)于(yu)(yu)SYBR Green I染料(liao)法優化的(de)(de)(de)高質(zhi)量qPCR檢測試(shi)劑盒(he)(he)，包含(han)KAPA SYBR® FAST qPCR Master Mix預先稀(xi)釋的(de)(de)(de)一系列DNA標(biao)準品(pin)，以及針對(dui)(dui)于(yu)(yu)人類(lei)基(ji)因組單拷(kao)貝的(de)(de)(de)高度保(bao)守區(qu)域的(de)(de)(de)不(bu)同位點所設計(ji)的(de)(de)(de)引物(wu)預混液。小片段所對(dui)(dui)應(ying)的(de)(de)(de)引物(wu)，用(yong)于(yu)(yu)獲(huo)得(de)定量的(de)(de)(de)結果，而額外的(de)(de)(de)引物(wu)，用(yong)于(yu)(yu)獲(huo)得(de)在DNA樣(yang)本(ben)中可(ke)擴(kuo)增模板量(質(zhi)量高的(de)(de)(de)DNA片段)的(de)(de)(de)信息。這個試(shi)劑盒(he)(he)由(you)此所產生的(de)(de)(de)質(zhi)量分數(即Q-ratios)，可(ke)以用(yong)于(yu)(yu)預測文庫的(de)(de)(de)產量，或者對(dui)(dui)于(yu)(yu)如FFPE DNA這類(lei)樣(yang)本(ben)質(zhi)量變化很大的(de)(de)(de)樣(yang)本(ben)的(de)(de)(de)工作流(liu)程進行調整。

產品特色

在單次(ci)檢測(ce)中，同時評(ping)估樣本量以(yi)及樣本質量

可以將質量分數(shu)(Q-ratios)與測(ce)序相(xiang)關(guan)指標相(xiang)關(guan)聯

高性能的KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix

預先(xian)稀釋好的DNA標準品以及可以直(zhi)接(jie)使用的引物

多功能、易于自動化的工(gong)作流程

建立樣(yang)本質量控制中低條件

指示樣品是否有足(zu)夠的量(liang)以及質(zhi)量(liang)來成功構建文庫

未通過質控的(de)樣本，不再進行后續文庫構建以(yi)及測序步(bu)驟，從而節約時間(jian)和(he)精力

通過檢(jian)測進行測序(xu)的樣本 (Sequenced Sample) 和Q值不夠、未(wei)進行測序(xu)的樣本(QNS，Not Sufficient) 各自的Q-ratios。

數據(ju)來源于Dartmouth-Hitchcock醫療中心(DHMC)的轉化(hua)醫學實驗(yan)室。在(zai)DNA抽提后以(yi)(yi)及文庫(ku)構建(jian)之前(qian)，使用(yong)KAPA hgDNA定量(liang)&QC 試劑盒，可以(yi)(yi)幫助使用(yong)者(zhe)建(jian)立(li)一個額外的質量(liang)控制流程(cheng)，用(yong)于在(zai)早期(qi)的過程(cheng)中預測測序的質量(liang)。DHMC在(zai)其(qi)擴增子測序工作(zuo)流程(cheng)中，根(gen)據(ju)經驗(yan)，使用(yong)Q129/41 bp>0.5和Q305/41 bp > 0.2作(zuo)為判(pan)斷標準。

分析NGS文庫(ku)構建工作流程

Q-ratios可以幫助判斷(duan)NGS文庫構建工作流程(cheng)中的(de)瓶頸

對于FFPE樣本，文庫(ku)質量和測(ce)序(xu)中質量的主要限(xian)制(zhi)因素是(shi)：起始(shi)DNA轉化成連接(jie)有接(jie)頭的文庫(ku)分(fen)子的轉化率不(bu)高

文庫的轉(zhuan)化率，為在Illumina測序平(ping)臺上進行靶向重測序而制備

分(fen)別從樣(yang)(yang)(yang)本(ben)質量(liang)參差的(de)(de)80-100 ng FFPE DNA樣(yang)(yang)(yang)本(ben)(橙(cheng)色)和商用人類基因組(zu)DNA(灰色)，使(shi)用KAPA LTP文(wen)(wen)(wen)庫(ku)構建(jian)試(shi)劑盒(he)來(lai)構建(jian)測(ce)序文(wen)(wen)(wen)庫(ku)。FFPE DNA樣(yang)(yang)(yang)本(ben)在(zai)(zai)用Covaris打(da)斷之(zhi)前(qian)，用KAPA hgDNA定(ding)量(liang)&QC試(shi)劑盒(he)進行(xing)檢(jian)測(ce)，然后按照Q-ratios(DNA質量(liang))沿X軸升序排列。Q-ratios如圖中標(biao)(biao)注。片段化的(de)(de)DNA(平均大小在(zai)(zai)180 bp左右)在(zai)(zai)建(jian)庫(ku)之(zhi)前(qian)，用Qubit® HS dsDNA (Life Technologies) 進行(xing)定(ding)量(liang)；在(zai)(zai)連接(jie)接(jie)頭、形成文(wen)(wen)(wen)庫(ku)分(fen)子(zi)之(zhi)后，使(shi)用基于(yu)qPCR的(de)(de)KAPA文(wen)(wen)(wen)庫(ku)定(ding)量(liang)試(shi)劑盒(he)進行(xing)定(ding)量(liang)。結果顯(xian)示，FFPE樣(yang)(yang)(yang)本(ben)的(de)(de)文(wen)(wen)(wen)庫(ku)轉化率(lv)(Conversion Rate，起始DNA分(fen)子(zi)轉化成連接(jie)有接(jie)頭的(de)(de)文(wen)(wen)(wen)庫(ku)分(fen)子(zi)的(de)(de)百(bai)分(fen)比，%)明(ming)顯(xian)低(di)于(yu)高(gao)質量(liang)的(de)(de)DNA樣(yang)(yang)(yang)本(ben)，使(shi)得FFPE樣(yang)(yang)(yang)本(ben)的(de)(de)文(wen)(wen)(wen)庫(ku)分(fen)子(zi)多樣(yang)(yang)(yang)性受到(dao)限制，并且需要在(zai)(zai)文(wen)(wen)(wen)庫(ku)擴增步驟中采取更多的(de)(de)循(xun)環(huan)數(shu)才(cai)能得到(dao)足夠多的(de)(de)文(wen)(wen)(wen)庫(ku)分(fen)子(zi)進行(xing)靶(ba)標(biao)(biao)捕獲，從而使(shi)FFPE樣(yang)(yang)(yang)本(ben)的(de)(de)文(wen)(wen)(wen)庫(ku)的(de)(de)重復(fu)率(lv)(duplication rate) 更高(gao)，靶(ba)標(biao)(biao)覆蓋(gai)率(lv)(target coverage)更低(di)。

從FFPE DNA樣(yang)本中獲(huo)得(de)樣(yang)本制備的(de)可操作數據

Q129/41 比值(zhi)和測序中的關鍵指(zhi)標（如重復率）具有相關性

從250 ng Covaris打斷的(de)(de)FFPE DNA樣(yang)本(ben)(ben)(n=14)和(he)對(dui)(dui)照組(zu)(zu)DNA(分(fen)別從培養細胞(bao)、新(xin)鮮冰凍樣(yang)本(ben)(ben)和(he)血(xue)液中(zhong)(zhong)提(ti)取，n=6)，進(jin)(jin)行手動文(wen)庫(ku)構建。樣(yang)本(ben)(ben)按(an)照Q129/41-比例升(sheng)序在(zai)x軸(zhou)上從左至右排列(lie)(FFPE樣(yang)本(ben)(ben)用黃(huang)色(se)表示，對(dui)(dui)照組(zu)(zu)DNA用橙(cheng)色(se)表示)。文(wen)庫(ku)構建采用的(de)(de)是NEBNext® 試劑(New England Biolabs)，其中(zhong)(zhong)靶標(biao)捕(bu)(bu)獲(huo)前和(he)靶標(biao)捕(bu)(bu)獲(huo)后的(de)(de)擴增環(huan)節(10個(ge)循環(huan))采取KAPA HiFi 試劑盒。靶標(biao)捕(bu)(bu)獲(huo)使用的(de)(de)是定制(zhi)的(de)(de)SeqCap EZ panel (300 genes,0.9 MB)。 在(zai)Illumina HiSeq平臺上進(jin)(jin)行了測序(2 x 100 bp)。FFPE樣(yang)本(ben)(ben)的(de)(de)平均靶標(biao)覆蓋率(藍(lan)色(se)點)是對(dui)(dui)照組(zu)(zu)的(de)(de)四倍(1,247X, vs. 301X)，平均重復率(紅色(se)點)是對(dui)(dui)照組(zu)(zu)的(de)(de)兩倍(75% vs. 38%)。Q129/41 比值 > 0.4 的(de)(de)FFPE樣(yang)本(ben)(ben)所產(chan)出的(de)(de)文(wen)庫(ku)能夠達到低(di)測序質量(liang)要求。

訂貨信息

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