在這(zhe)里，我們(men)介紹TwistAmp®液體，一種新的(de)(de)PCR替代形式，使RPA技術(shu)更適用(yong)(yong)于廣泛的(de)(de)研(yan)究應(ying)用(yong)(yong)。與(yu)PCR擴(kuo)增相比，RPA只(zhi)需幾分鐘，而不是幾個(ge)小(xiao)時(shi)，可以運行(xing)不需要(yao)額外設備。TwistAmp®Liquid Basic和Basic試(shi)劑盒可用(yong)(yong)于需要(yao)良(liang)好保真度，凝膠(jiao)電泳或固相檢測的(de)(de)應(ying)用(yong)(yong)。TwistAmp®Liquid exo和exo允(yun)許快速(su)實時(shi)擴(kuo)增和檢測目標而不犧牲靈敏度或特異性(xing)。

概述

      圖1:RPA循環，重組酶蛋白(bai)與引物形成重組絲，并將其插入DNA雙螺(luo)旋的(de)互補位(wei)點，形成d環。單鏈(lian)dna結(jie)(jie)合(SSB)蛋白(bai)穩(wen)定雙螺(luo)旋結(jie)(jie)構和(he)d環的(de)開放。重組酶的(de)分解(jie)允(yun)許鏈(lian)置換聚合酶沿著目(mu)標(biao)序列延伸引物的(de)3端(duan)。當對相反(fan)的(de)引物重復(fu)這個序列時，指數擴增(zeng)發生而不需要熱變性或退火。

      自2008年推出(chu)以(yi)來，TwistAmp®試(shi)(shi)劑盒(he)為(wei)科學家提供了一種簡單的(de)(de)(de)方法來進行(xing)重組酶聚合(he)(he)酶擴增(RPA)，迄今為(wei)止已(yi)有250多篇關于該(gai)技(ji)術的(de)(de)(de)同行(xing)評審(shen)出(chu)版(ban)物(wu)。RPA是一種等溫替(ti)代(dai)聚合(he)(he)酶鏈(lian)(lian)反(fan)(fan)(fan)應(PCR)的(de)(de)(de)方法，它使(shi)(shi)用(yong)(yong)(yong)三種蛋(dan)白(bai)質(重組酶，單鏈(lian)(lian)dna結合(he)(he)蛋(dan)白(bai)和(he)鏈(lian)(lian)置換聚合(he)(he)酶)來代(dai)替(ti)熱循(xun)(xun)環(huan)(圖(tu)1)。RPA在(zai)(zai)恒定低溫下(xia)(理想(xiang)情況下(xia)為(wei)37-42°C)效果，反(fan)(fan)(fan)應速度非常快(kuai)(反(fan)(fan)(fan)應時間(jian)小于20分鐘(zhong))，可以(yi)用(yong)(yong)(yong)穩定的(de)(de)(de)凍干顆(ke)粒啟(qi)動，這使(shi)(shi)得它非常適合(he)(he)即時測試(shi)(shi)。此外，RPA用(yong)(yong)(yong)戶已(yi)經在(zai)(zai)各種不同的(de)(de)(de)應用(yong)(yong)(yong)中測試(shi)(shi)了TwistAmp®試(shi)(shi)劑盒(he)試(shi)(shi)劑，包括那些傳統上使(shi)(shi)用(yong)(yong)(yong)PCR的(de)(de)(de)試(shi)(shi)劑(如最近(jin)對RPA應用(yong)(yong)(yong)的(de)(de)(de)回顧所(suo)述1)。與PCR一樣(yang)，簡單的(de)(de)(de)RPA使(shi)(shi)用(yong)(yong)(yong)兩種相反(fan)(fan)(fan)的(de)(de)(de)引物(wu)以(yi)指數(shu)方式擴增DNA的(de)(de)(de)特定區域。RPA引物(wu)對遵循(xun)(xun)與PCR引物(wu)相似(si)的(de)(de)(de)設計規則，并且為(wei)PCR反(fan)(fan)(fan)應開發的(de)(de)(de)引物(wu)通常在(zai)(zai)RPA反(fan)(fan)(fan)應中表現良好。

關于TwistAmp®Liquid試劑盒

     為了鼓勵這種多為了鼓勵這種多用途的RPA技術，TwistDx™開發并推出了TwistAmp®液體試劑盒，為用戶提供更靈活的試劑。TwistAmp®Liquid試劑盒類似于在每個分子生物學實驗室冷凍室中發現的預制PCR master mixes，包括核心RPA蛋白混(hun)(hun)合物的甘油儲存管(guan)(guan)(guan)，一(yi)管(guan)(guan)(guan)緩沖液，一(yi)管(guan)(guan)(guan)驅動(dong)重(zhong)組過程所需的能(neng)量混(hun)(hun)合物和一(yi)管(guan)(guan)(guan)用于蛋白質(zhi)的醋酸鎂(mei)輔助因子(zi)。

      有四(si)種TwistAmp®液體(ti)(ti)試(shi)劑(ji)(ji)(ji)盒(he)可用(yong)(yong):基(ji)本(ben)(ben)和(he)(he)(he)(he)基(ji)本(ben)(ben)RT擴(kuo)增無探針，適用(yong)(yong)于凝膠電泳，固相(xiang)擴(kuo)增和(he)(he)(he)(he)微陣(zhen)列應用(yong)(yong)與(yu)(yu)尾部引物和(he)(he)(he)(he)適配(pei)體(ti)(ti);exo和(he)(he)(he)(he)exo RT，它(ta)們與(yu)(yu)基(ji)于探針的(de)(de)(de)(de)實時(shi)檢(jian)(jian)測(ce)(ce)方(fang)法兼容。所有四(si)個(ge)試(shi)劑(ji)(ji)(ji)盒(he)包(bao)(bao)含相(xiang)同(tong)(tong)的(de)(de)(de)(de)核(he)心反應混合物，重組酶(mei)，單(dan)鏈結合蛋白和(he)(he)(he)(he)鏈置換聚合酶(mei)的(de)(de)(de)(de)比例與(yu)(yu)凍干(gan)的(de)(de)(de)(de)TwistAmp®基(ji)本(ben)(ben)試(shi)劑(ji)(ji)(ji)盒(he)相(xiang)同(tong)(tong)。因此，當使(shi)用(yong)(yong)液體(ti)(ti)試(shi)劑(ji)(ji)(ji)盒(he)時(shi)，使(shi)用(yong)(yong)凍干(gan)的(de)(de)(de)(de)TwistAmp®基(ji)本(ben)(ben)試(shi)劑(ji)(ji)(ji)盒(he)進(jin)行的(de)(de)(de)(de)分(fen)析當然應該表現得(de)非常相(xiang)似，但(dan)使(shi)用(yong)(yong)其他凍干(gan)的(de)(de)(de)(de)TwistAmp®試(shi)劑(ji)(ji)(ji)盒(he)進(jin)行的(de)(de)(de)(de)分(fen)析在使(shi)用(yong)(yong)液體(ti)(ti)試(shi)劑(ji)(ji)(ji)盒(he)時(shi)可能(neng)會顯示出不同(tong)(tong)的(de)(de)(de)(de)分(fen)析性能(neng)。圖2顯示：使(shi)用(yong)(yong)TwistAmp®exo RT和(he)(he)(he)(he)TwistAmp®Liquid exo RT進(jin)行的(de)(de)(de)(de)檢(jian)(jian)測(ce)(ce)均(jun)檢(jian)(jian)測(ce)(ce)到(dao)50份人(ren)呼吸道(dao)合胞病毒B RNA模板。除(chu)了Core Reaction Mix外，exo試(shi)劑(ji)(ji)(ji)盒(he)還包(bao)(bao)含一(yi)管(guan)外切(qie)酶(mei)III，用(yong)(yong)于處理TwistAmp®外切(qie)酶(mei)探針進(jin)行實時(shi)熒(ying)光檢(jian)(jian)測(ce)(ce)，RT試(shi)劑(ji)(ji)(ji)盒(he)包(bao)(bao)含一(yi)管(guan)逆轉(zhuan)錄酶(mei)，用(yong)(yong)于將RNA單(dan)步轉(zhuan)化為cDNA并(bing)隨后擴(kuo)增。

     TwistAmp®液體試劑盒，類似(si)于(yu)(yu)他們(men)的(de)(de)(de)凍干(gan)對(dui)應試劑盒，配制允許擴(kuo)增(zeng)片段高達500個堿基(ji)對(dui)的(de)(de)(de)大小(xiao)，這(zhe)足以用(yong)于(yu)(yu)許多常見的(de)(de)(de)PCR實(shi)驗(yan)室(shi)用(yong)途(不同的(de)(de)(de)蛋白質制劑正(zheng)在(zai)(zai)開發(fa)，以允許更長的(de)(de)(de)擴(kuo)增(zeng)子)。這(zhe)使得RPA成(cheng)為(wei)許多標準(zhun)實(shi)驗(yan)室(shi)克(ke)隆(long)和測序方(fang)(fang)案中取代(dai)PCR的(de)(de)(de)優秀候(hou)選者。當用(yong)于(yu)(yu)Illumina下一代(dai)測序文庫制備時，RPA比(bi)校對(dui)聚合(he)酶(如(ru)Kapa HiFi和Platinum pfx2)導(dao)致的(de)(de)(de)錯誤更少。此外，在(zai)(zai)為(wei)合(he)成(cheng)生物學開發(fa)的(de)(de)(de)端到端自動化(hua)微流控平臺(tai)上，利(li)用(yong)Gibson克(ke)隆(long)的(de)(de)(de)等溫變體，RPA已(yi)被用(yong)于(yu)(yu)生成(cheng)更長的(de)(de)(de)754堿基(ji)對(dui)片段，從而證明了在(zai)(zai)已(yi)建立的(de)(de)(de)聚焦pcr方(fang)(fang)案中成(cheng)功(gong)實(shi)施(shi)RPA。

TwistAmp®Liquid試劑盒優勢

      與凍干的TwistAmp®試劑盒相比，TwistAmp®Liquid的一個關鍵優勢是，科學家可以根據需要使用盡可能多或盡可能少的TwistAmp®試劑，在他們選擇的容器中進行反應。與PCR不同的是，RPA是等溫的，在相對較低的最佳溫度下工作，并且可以耐受過低溫度和溫度波動。在將主混合物輸送到反應體系之前不需要預熱，并且在較低的等溫溫度下，蒸發和冷凝的影響不是主要問題。這意味著在小的、分區的微流體裝置體積中的熱控制得到了簡化:RPA已被證明可以在非常小的(皮升)體積中工作4。RPA的這些屬性也意味著它可以用于比PCR理想的更大體積的反應。圖3顯示：一對PCR引物5成功擴增了淋病奈瑟菌269堿基對片段，反應量為2.5 ~ 5000微升。因此，TwistAmp®液體反應可以在從定制的微流體裝置到標準實驗室96孔板到微離心管，甚至更大的容器中運行。

選擇TwistAmp®液體試劑盒而不是凍干TwistAmp®試劑盒的科學家有更多的選擇性，因為TwistAmp®液體試劑盒不包括脫氧核糖核苷酸三磷酸(dNTPs)。因此，可以用三磷酸脫氧尿苷(dUTP)或標記的核苷酸進行檢測，以允許擴增子捕獲或比色或電化學檢測6 - 8。

總結

RPA已在250多項外部研究(jiu)中得到應(ying)用，并在眾多應(ying)用和領域(yu)中越來越具(ju)有優勢。我(wo)們的新(xin)型(xing)TwistAmp®液體是實(shi)驗(yan)室分子生物學研究(jiu)中第一(yi)個可行(xing)的PCR替代(dai)品。

1. Lobato, I.M. & O’Sullivan, C.K. Trends Analyt. Chem. 98, 19–35 (2018).

2. Oyola, S.O. et al. BMC Genomics 13, 1 (2012).

3. Linshiz, G. et al. J. Biol. Eng. 10, 3 (2016).

4. Li, Z. et al. PLoS One 11, e0153359 (2016).

5. Sachdev, D., Patel, A.L., Sonkar, S.C., Kumari, I. & Saluja, D. Biomed Res. Int. 2015,

597432 (2015).

6. Koo, K.M., Wee, E.J. & Trau, M. Theranostics 6, 1415–1424 (2016).

7. Wee, E.J., Ngo, T.H. & Trau, M. Clin. Epigenetics 7, 65 (2015).

8. Lau, H.Y. et al. Sci. Rep. 7, 38896 (2017). ;

默瑞生物

默瑞(上(shang)海(hai))生(sheng)物(wu)科(ke)技有限公司，作為(wei)專(zhuan)業的生(sheng)命科(ke)學(xue)產品(pin)推廣與(yu)服務(wu)商，以“創(chuang)新，專(zhuan)業，共贏"的理念，不斷強化服務(wu)體(ti)系，提升客(ke)戶體(ti)驗，結合國內外優質產品(pin)提供高標準完(wan)整解決(jue)方(fang)案，幫助科(ke)研客(ke)戶和(he)生(sheng)物(wu)技術(shu)企業高效創(chuang)新，加速(su)轉化，創(chuang)造更多優質產品(pin)，提升社會福(fu)祉，實(shi)現(xian)多方(fang)共贏。

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