當(dang)細(xi)胞(bao)生物學(xue)(xue)家(jia)第(di)一(yi)次發現可能有一(yi)種(zhong)脂質參與他(ta)們最喜歡的(de)途徑時(shi)，這有點(dian)像在馬路對面找到(dao)一(yi)堵墻(就像當(dang)脂質學(xue)(xue)家(jia)在他(ta)們的(de)路上找到(dao)一(yi)種(zhong)蛋白質一(yi)樣……)。

      由(you)于脂質(zhi)的(de)(de)不(bu)同性質(zhi)，大多數細胞生物學家都害怕在他們的(de)(de)研究過程(cheng)中(zhong)不(bu)得(de)不(bu)面對這(zhe)種情(qing)況。好消(xiao)息是，有一(yi)(yi)些(xie)簡單的(de)(de)方(fang)法可以幫助克服這(zhe)一(yi)(yi)障(zhang)礙，使研究特(te)定途徑中(zhong)的(de)(de)脂質(zhi)變得(de)更容(rong)易(yi)。在這(zhe)里，我(wo)想介紹一(yi)(yi)些(xie)脂配體相(xiang)互(hu)作用(yong)研究的(de)(de)分(fen)析和準備(bei)工具。

1 覆蓋(gai)試驗Overlay assays-鑒定與給(gei)定蛋白質相互作(zuo)用的脂質

      這些分析方(fang)法(fa)允許鑒定一種或多種脂質與(yu)給定蛋(dan)白質相互作用。

      與Western-blot原理類似，它(ta)們的(de)原理是(shi)在表面(mian)涂上各種類型的(de)脂質(zhi)(zhi)，這(zhe)些(xie)脂質(zhi)(zhi)將(jiang)與已知的(de)蛋(dan)白(bai)質(zhi)(zhi)接(jie)觸(chu)，這(zhe)種蛋(dan)白(bai)質(zhi)(zhi)將(jiang)被標(biao)記(ji)或(huo)抗(kang)體臨時檢測到。脂質(zhi)(zhi)的(de)載(zai)體通常(chang)是(shi)硝化(hua)纖維素膜(圖1)。與點印跡法一樣，需要優化(hua)一些(xie)實驗參數(shu)(如緩沖液、蛋(dan)白(bai)質(zhi)(zhi)純化(hua)或(huo)蛋(dan)白(bai)質(zhi)(zhi)濃度)。

      當可(ke)用蛋白(bai)質的(de)數量有，小的(de)“覆蓋分析格(ge)式"可(ke)以(yi)用少于0.5 mg的(de)蛋白(bai)質進行檢測。這是一(yi)種簡(jian)單的(de)方(fang)法來測試一(yi)種感興趣的(de)蛋白(bai)質對各種脂質的(de)結合(he)能力!

2 下拉試(shi)驗Pull-down assays-發現一(yi)種已知脂質的蛋(dan)白質伙伴(ban)

      對于相反的(de)實驗設置，當(dang)您想要識別已知(zhi)脂質(zhi)的(de)蛋白質(zhi)伴侶(lv)時(shi)，瓊脂糖(tang)為基(ji)礎的(de)下拉試驗等制備技術將(jiang)是(shi)您的(de)選擇:

*瓊脂糖珠包被確定的脂質可以被進一步孵育與細胞裂解液，上清液，重組蛋白…

* 然后相互作用的復合體通過離心將它們拉下來。

       它(ta)允許分離脂(zhi)質結合蛋白的數量適合進一步鑒定和表征。它(ta)經常(chang)與細胞(bao)裂解液一起用于“撈出"脂(zhi)質對偶物(圖4)。

3 漂浮試驗Floatation assays-用于更高特異性的蛋白(bai)質(zhi)-脂質(zhi)相互作用

       當你在尋找更高(gao)特(te)異(yi)性的蛋(dan)白質-脂(zhi)質相互作(zuo)用(yong)時，另一(yi)種基(ji)于脂(zhi)質富集脂(zhi)質體(ti)(用(yong)作(zuo)脂(zhi)質/配體(ti)相互作(zuo)用(yong)的基(ji)質支持)的制(zhi)備方(fang)法是可(ke)用(yong)的。

       與GEM脂(zhi)筏提取(葡(pu)萄糖梯度超(chao)離心)類似，脂(zhi)質體預結(jie)合到脂(zhi)質配(pei)體上，將沿著超(chao)離心制備的葡(pu)萄糖梯度分成(cheng)幾個(ge)部分分布(圖5)。

這些富(fu)脂(zhi)脂(zhi)質體有許(xu)多(duo)優點(dian):

*聚脂質體PolyPIPosomes是聚合(he)的脂質體，

*增加穩定性(xing)(長達6個(ge)月(yue))，

*生物素標簽，方便鏈(lian)霉(mei)親和素檢測，

*尺(chi)寸均勻(~200 nm)，可進行浮(fu)選試驗，

*這些脂質體也可用(yong)于:表(biao)面等離子體共振(zhen)，脂質體覆蓋分析(xi)，ITC。

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